Главная


микроскоп

Реакция связывания комплемента. Варианты методики

Первый вариант: связывание комплемента рассматривается как простая линейная зависимость от количества иммунных комплексов. По мере прибавления комплемента линейная зависимость достигает своего максимума. Комплемент постепенно добавляют, пока не будет достигнуто 50% связывание. Титр рассчитывают методом экстраполяции. Его определяют как число СН50 (единица активности комплемента, вызывающая 50% гемолиз), которое необходимо прибавить к 0,05 мл антисыворотки, чтобы оставалась свободная 1 СН50. В данном методическом варианте определяют количество связывающегося комплемента, причем возможно одно-, двух- и трехкомпонентное титрование.

Однокомпонентное: определяют разведение сыворотки, антигена, комплемента, вызывающее 50% гемолиз.

Двухкомпонентное: определяют необходимое количество комплемента, вызывающее 50% гемолиз в условиях различных разведений АС при постоянном количестве АГ или в условиях различных разведений антигена при постоянном количестве антисыворотки.

Трехкомпонентное: определяют количество комплемента, вызывающее 50% гемолиз для каждого соотношения антиген-антитело.

Второй вариант: используют постоянные количества комплемента, оптимальную дозу антигена и различные разведения сывороток. Измеряют количество комплемента, связанное различными формами иммунных комплексов. Количество комплемента соотносится графически с количествами сыворотки, титр определяют как обратную величину количества сыворотки, которое необходимо для связывания от 50 до 100 СН50. Для выявления АТ (антитело) можно пользоваться вариантом 1.

При постановке реакции связывания комплемента необходимо обратить внимание на следующие факторы: подбор эритроцитов и их концентраций, качество амбоцептора, время и температуру инкубации, объемы реагентов, ингибирующее и активирующее комплемент действие антигенов, сывороток, эффект прозоны и др.

Определение единицы комплемента

Делают несколько рядов разведений комплементсодержащей сыворотки и смешивают их с сенсибилизированными эритроцитами. Середина сигмовидной кривой гемолиза соответствует наивысшей чувствительности и, следовательно, наиболее пригодна для титрования.

Процесс гемолиза можно описать следующим уравнением

X — количество внесенного комплемента; Y — лизис в %;
К — константа, зависящая от концентрации клеток и участвующих в реакции объемов.

Согласно вышеприведенной формуле Krogh, отношение концентрации адсорбированного вещества y к концентрации адсорбирующего вещества х при 1/n пропорционально концентрации остающегося вещества. Если в серии опытов

Преобразование уравнения в логарифмическую форму дает следующее выражение:

Этому выражению соответствует уравнение прямой u = a + b · v. На графике v откладывают по оси абсцисс, а u — по оси ординат, В в этом случае будет касательной к углу наклона:

К и 1/n— константы, n определяют исходя из уравнения касательной. 1/n зависит от количества комплемента, эта величина растет с уменьшением количества комплемента, log х можно получить линейной интерполяцией по
log      у  
        1-y
Интенсивность реакции снижается как в случае избытка антигена, так и антител. Mayer и сотр. пришли к выводу, что степень связывания комплемента следует оценивать по остаточной гемолитической активности с последующим вычитанием этой величины из средней величины активности в контроле (буфер, антиген, антитела). Было установлено, что чем сильнее сенсибилизация антителами, тем быстрее, при постоянном количестве комплемента происходит лизис клеток. При одной и той же степени сенсибилизации снижение количества комплемента вызывает уменьшение скорости гемолиза. Значение СН50 поэтому зависит от используемой системы определения активности комплемента. По Mayer, за 1 СН50 принимают такое количество мл свежей сыворотки морской свинки, которое вызывает лизис 2,5х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов из общего количества 5х108 клеток, суспендированных в 7,5 мл буфера с ионной силой 0,147 и с оптимальным содержанием Са2+ и Mg2+ в течение 1 часа при 37°С. Графическое изображение результатов гемолиза на логарифмической бумаге позволяет превратить сигмоидальную кривую в прямую. Калибровочную кривую рассчитывают по выражению

Log H% = m · log (Ext x 100) + b

где m — угол наклона, вычисляемый графически и аналитически,
b — точка пересечения прямой гемолиза с ординатой Е — 0,01

log H%E 0.01 = log H% - n · u · m/log tg + lg [ lg (E · 100) ]

Соответствующую калибровочную кривую получают на фотометре в предварительном эксперименте. Графический пример приведен на рисунке.

Определение активности комплемента при помощи логарифмической сетки

Определение активности комплемента при помощи логарифмической сетки

Комплемент I: 50% гемолиза-38 ЕД, 100% гемолиза=26 ЕД.
Комплемент II: 50% гемо-лиза-51 ЕД, 100% гемолиза-27 ЕД.

Характеристика антигенов

Особое значение для точности реакции связывания комплемента имеет вид антигена и способ его внесения. Оценка антигена проводится в отношении его специфического антигенного действия и его способности ингибировать комплемент. Одной из важных характеристик комплемента являются кривые изофиксации при различных концентрациях комплемента.

Кривые изофиксации антигена при различных разведениях комплемента

Кривые изофиксации антигена при различных разведениях комплемента

SV — разведение сыворотки; AgV — разведение комплемента;
ML — максимальные линии, AML — максимальные линии антигена

При этом можно количественно и качественно сравнивать антигены и иммуноглобулины. Изменяя относительные концентрации антигенов, удается наблюдать расщепления «плеча антител», предпринимались также попытки дифференцировать антигены по изменению форм кривых при минимально определяемых количествах антител. В системе логарифмических координат можно провести линии максимума антигенов и сывороток, включающих так называемую упрощенную максимальную линию. Учитывая весьма различное качество антигенов, на практике бывает очень трудно точно определить эти линии. Относительно антисывороток следует сказать, что, очевидно, недостаточно установить оптимальное соотношение антигена и данной сыворотки, т. е. следует также обращать внимание на тип сыворотки и состав иммуноглобулинов антисыворотки. Для установления оптимальных количеств антигена, связывающего комплемент, применяемых в реакции связывания комплемента, необходимо определить следующие параметры: кривые изофиксации с различными разведениями комплемента, область прозоны, тип кривых изофиксации и зоны максимума (например, максимум антигена), а также дфференцировать ингибирующее комплемент и специфическое антигенное действие, определить оптимальное комплементзависимое разведение антигена, оценить величину ожидаемого рассеяния результатов, расширить имеющиеся сведения путем уточнения типа Ig, установить группы кривых изофиксации.