Главная


Доска объявлений автошкола запорожье.

Определение электрофоретической подвижности макрофагов. Методика

Материалы и оборудование

Для работы необходимы среда для культивирования клеток Игла-МЕМ (институт иммунных препаратов и питательных сред ГДР), вазелиновое масло стерильное, морские свинки (минимальный вес 300 г), цитоферометр (Opton, Oberkochen, ГДР), регистрирующее устройство с отсчетом времени (например, фотометр 20026 и рекордер 23144, Messelektronik, Дрезден), 0,15 М NaCl.

Проведение эксперимента

Непрямой MEM

Непрямой MEM

Для постановки непрямой MEM 106 лимфоцитов, полученных из гепаринизированной крови в градиенте плотности (см. раздел "Разделение клеток иммунной системы"), смешивают с исследуемым антигеном в общем объеме 3 мл среды Игла-МЕМ и инкубируют 90 мин при комнатной температуре. В качестве контроля берут просто среду Игла. Оптимальную концентрацию антигена определяют в предварительном опыте (например, для РРД 20 мкг/мл или для энцефалолитогенного белка человека 33 мкг/мл). Через 90минут смесь центрифугируют 10 минут при 300 g, бесклеточную надосадочную фракцию (БНФ) немедленно используют или сохраняют при —20°С. Инкубацию 8х106 макрофагов морской свинки с БНФ проводят при комнатной температуре. Препарат макрофагов готовят как было описано ранее (см. раздел "Реакция торможения миграции лейкоцитов (капиллярный метод)") из перитонеального экссудата морских свинок на 7—14-й день после введения им 20 мл стерильного вазелинового масла.

После инкубации определяют среднее время электрофоретической миграции макрофагов в микрофоретической камере (цитоферометр) при 23 °С. Определяют время миграции приблизительно 30 макрофагов через постоянный отрезок измерительного поля окуляра (16 мкм). Проводят двойные измерения (в прямом и обратном направлении при смене полюсов). Для анализа используют только те пары измерений, в которых различия длительности прямого и обратного движения не превышают 10%. Для анализа отбирают макрофаги с диаметром около 16 мкм, имеющих 2—3 включения вазелинового масла, поскольку на таких клетках отмечается наибольший тормозящий эффект. Изменение времени электрофоретической миграции макрофагов в сравнении с контрольной пробой выражают как процент торможения (Т%).

где t пр — средняя электрофоретическая подвижность макрофагов в пробе,
t контр—средняя электрофоретическая подвижность макрофагов в контрольной пробе

Описание контроля см. рис. 106, кроме того, ставят контрольные пробы I и II (макрофаги в присутствии антигена и без него) для исключения неспецифического воздействия АГ на макрофаги. В качестве позитивного контроля можно поставить пробу с РРД, поскольку практически все индивиды имеют ту или иную степень сенсибилизации к туберкулину.